食用被大肠杆菌污染的食物往往会造成了严重的伤害,如群发性腹泻、呕吐等。食品防腐 剂大致上可以分为两类,即化学防腐剂和天然防腐剂。天然防腐剂是从植物、动物和微生物中获得的具有抗菌和防腐活性的物质,安全性高且对环境友好。二氢槲皮素(DHQ),也称黄杉素、紫杉叶素、花旗松素,是一种从植物中提取出的二氢黄酮醇类化合物,有多项研究表明DHQ具有抑菌活性。
目前鲜见DHQ抑菌机理相关研究的报道,因此 山西大学应用化学研究所的蔡瑾、王梦亮和山西大学中医药现代研究中心的闫然等 测定了DHQ对常见食源性病菌的抑制活性,在确定大肠杆菌作为指示菌的基础上,观察大肠杆菌被DHQ作用后的形态变化,检测其胞内活性氧(ROS)水平、细胞受损伤所致程度、膜电位变化、胞内Ca2+含量以及细胞周期变化,进而分析大肠杆菌受DHQ抑制的机理。
图1根据结果得出DHQ对6 种食源性病菌的抑菌圈直径均在10 mm以上,均显著大于阴性对照的抑菌圈直径(P<0.05),即DHQ对6 种食源性病菌均有显著的压制效果(P<0.05)。经ANOVA分析确定DHQ对6 种食源性病菌抑制作用强弱差异,根据结果得出DHQ对大肠杆菌有最佳的抑制作用(21.13 mm)(P<0.05),对普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的抑制作用次之(18.88、18.40 mm),对枯草芽孢杆菌以及产气肠杆菌的抑制作用较弱(14.67、13.90 mm),抑制金黄色葡萄球菌的作用最弱(12.35 mm)。
如表1所示,当DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的处理质量浓度为0.02~1.25 mg/mL时,培养基呈现不同程度的浑浊现象;当处理质量浓度为2.5~20 mg/mL时,培养基清澈,没有病菌生长,因此质量浓度2.5 mg/mL被确定为DHQ对金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌的MIC。当DHQ以0.020~0.625 mg/mL的质量浓度处理枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌时,培养基表现出不同的浑浊度;当处理质量浓度为1.25~20.00 mg/mL时,培养基是清澈的,确定DHQ对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和热带假丝酵母菌的MIC为1.25 mg/mL。当DHQ对大肠杆菌的处理质量浓度为0.020~0.313 mg/mL时,培养基出现浑浊现象;当处理质量浓度为0.625~20.000 mg/mL时,没有病菌生长,确定0.625 mg/mL为DHQ对大肠杆菌的MIC。
结合抑菌圈直径和MIC检测结果,能够准确的看出DHQ对大肠杆菌具有最强的抑制活性,因此选择大肠杆菌作为进一步研究DHQ抑菌机理的指示菌。
SEM和TEM的结果能够直观地反映大肠杆菌被DHQ破坏的情况(图2)。对照组中大肠杆菌细胞表面十分光滑,呈现出规则的杆状结构(图2A-1、图2E-8)。经DHQ处理后,大肠杆菌的形态与对照组相比有明显不同(图2B~D、F~H)。图2B、F为由1/2 MIC的DHQ处理的大肠杆菌,虽然有些菌体细胞形态完好,但慢慢的开始出现溶胀聚集现象(图2B-2),内容物溢出形成了空洞(图2F-9、10),有些细胞出现轻微的质壁分离现象(图2F-11)。经质量浓度为MIC的DHQ处理(图2C、G)后,细胞出现折叠黏连现象(图2C-3、4、5),亦有空泡结构(图2G-12),质壁分离明显(图2G-13)。大肠杆菌被2 MIC的DHQ处理后,亦有折叠现象(图2D-6),菌体结构出现非常明显的变形(图2H-14、15)、破裂(图2H-16)、降解(图2D-7)。DHQ的化学名为3,5,7,3’,4’-五羟基-2,3双氢黄酮醇,具有黄酮类化合物的基本结构。DHQ的多羟基位于其结构内部斥电子的大P-π共轭体系中,羟基中的氢原子容易脱离。因此,推测DHQ作用大肠杆菌后,羟基中的氢原子可能与细胞膜中的磷脂分子以氢键的形式相结合,使得膜结构变得疏松,导致膜通透性增加,出现菌体肿胀、质壁分离等现象。当DHQ的质量浓度进一步增加,菌体结构变形,并出现黏连破裂等现象。
由图3可知,与对照组荧光强度(36.65)相比,DHQ处理组的荧光强度分别增加到了41.14(1/2 MIC)、56.99(MIC)以及65.94(2 MIC)。经DHQ处理的大肠杆菌细胞的荧光强度明显高于阴性对照的荧光强度(P<0.05)。ROS主要是通过氧化呼吸链产生和累积。细菌的呼吸作用主要由细胞膜上相关的酶催化反应进行,因此细胞膜是细菌产生ROS的主要位点。经DHQ处理后,DCFH-DA探针的荧光强度明显地增强,推测DHQ能刺激胞内的ROS过度产生。细胞膜中的脂质会因为过多的ROS而过氧化,导致细胞膜的流动性降低。
AnnexinV-FITC/PI双标记图显示4 种不同状态的细胞,左下(LL)、右下(LR)、右上(UR)、左上(UL)分别表示活细胞、受伤细胞、死细胞、坏死细胞与碎片。结合图4A~D能够准确的看出,大肠杆菌在LL区的占比随着DHQ质量浓度的增加而慢慢地减少,而LR区域大肠杆菌的占比增加。从图4E、F能够准确的看出,与阴性对照相比,MIC和2 MIC DHQ处理后,正常的大肠杆菌占比显著下降(P<0.05),受损细胞占比显著上升(P<0.05)。由此推测,DHQ的处理可以使大肠杆菌细胞膜的通透性增加,完整性被破坏,进而影响细胞的正常生理活动,使活细胞减少。
如图5所示,阴性对照表现出较强的荧光强度,为68.97,随着DHQ质量浓度的增加,荧光强度逐渐降低,1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ处理后的大肠杆菌荧光强度分别为43.38、35.07、34.69。与阴性对照相比,DHQ处理后的大肠杆菌细胞荧光强度明显降低(P<0.05)。以上根据结果得出,RH-123进入细胞内的动力减弱,即细胞膜内外电势差减少,由此能够推测出DHQ会引起大肠杆菌细胞膜去极化,使膜电位降低,进一步造成胞内离子紊乱,细胞的正常生理功能受到损伤。
如图6所示,与对照组的荧光强度(44.31)相比,DHQ处理组的荧光强度减少到了33.13(1/2 MIC)、29.82(MIC)以及28.33(2 MIC)。大肠杆菌被DHQ处理后的荧光强度与阴性对照相比明显降低(P<0.05)。在正常细胞中,胞内Ca2+的含量处在稳定水平,当细胞膜通透性受损后,会导致Ca2+的外漏。因此,胞内Ca2+含量的变化可以反映出细胞膜通透性的变化。以上根据结果得出DHQ处理后的大肠杆菌胞内Ca2+含量减少,推测DHQ可导致细胞膜损伤、Ca2+外漏,并直接影响到由Ca2+所参与的菌体的正常生长代谢和功能活动。
图7显示了DHQ处理后对大肠杆菌细胞周期的影响。经DHQ处理后,处于I期的大肠杆菌占比从82.99%(阴性对照)下降到了73.26%(1/2 MIC)、71.96%(MIC)、64.84%(2 MIC),处于R期的大肠杆菌占比从17.01%(阴性对照)上升到了26.74%(1/2 MIC)、28.04%(MIC)、35.16%(2 MIC)。DHQ处理后大肠杆菌处于I期的占比与对照组相比显著下降(P<0.05),处于R期的占比显著上升(P<0.05)。以上根据结果得出,DHQ对大肠杆菌的抑制作用与其干扰细胞周期有关。推测原因可能为DHQ损伤菌体的细胞膜,进入细胞内部,引起ROS在菌体内聚集,破坏了与DNA合成有关的酶或蛋白质,从而干扰了大肠杆菌正常的细胞周期。
从植物中提取的DHQ能抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和热带假丝酵母菌的生长,其中对大肠杆菌的抑菌效果最好,所以最终选择大肠杆菌作为抑菌机理实验的指示菌。DHQ会使得菌体内ROS含量增加,细胞膜的完整性和通透性受到损坏,细胞严重变形,出现黏连、折叠等现象;细胞膜电位降低,发生去极化现象,造成胞内离子紊乱,导致Ca2+等离子外漏,影响细胞生长代谢;使细胞周期滞留在R期,正常的细胞周期受到了干扰。本实验证实了DHQ对大肠杆菌等食源性病原菌具有显著抑制活性,并阐述了其抑菌机理。实验结果可为DHQ作为植物源食品防腐剂应用于食品安全领域提供理论参考。
本文《二氢槲皮素对大肠杆菌的抑菌作用机理》来源于《食品科学》2023年44卷第19期18-26页,作者:蔡瑾, 闫然, 王梦亮, 等。DOI:10.7506/spkx0512-148。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑:美娟;责任编辑:张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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